来源：扬州大学兽医学院
近日，世卫组织警告高毒力高耐药肺炎克雷伯菌正在全球蔓延，对人类健康造成极大威胁。伴随日益严峻的抗生素滥用问题，抗生素耐药也引发多领域研究者的关注。
我院王志强教授团队李瑞超教授等基于齐碳科技纳米孔测序平台，对首次在中国动物源性食品样本中分离鉴定出携带tet(X4)基因的高耐药性高毒力肺炎克雷伯菌进行分子特征和基因组学研究。相关研究成果《Emergence of tet(X4)-positive hypervirulent Klebsiella pneumoniae of food origin in China》已于2023年1月发表在期刊LWT上。该研究发现再次突出了全球范围内进行耐药菌监测的紧迫性。
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种机会致病性病原体，常趁虚而入导致免疫力低下人群发生感染，由于能够获得外源抗生素耐药基因和毒力因子，使其已成为全球临床和公共卫生机构重点关注的病原之一。其中，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌 (CRKP) 和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKp)是两种临床危害较大的肺炎克雷伯菌亚型。 hvKp 是一种具有高度致病性的肺炎克雷伯菌，已在世界许多地区广泛传播，主要引起社区感染，既往一般不认为其与动物来源的肺炎克雷伯菌有关，导致对动物来源hvKp缺乏了解。MDR-hvKp是近年来进化出的一种新型肺炎克雷伯菌，可携带多种临床重要抗生素的耐药基因，同时表现出高度致病性，在造成严重感染的同时限制了临床用药的选择，因此具有更大威胁。 CR-hvKp同时具有高致病性和碳青霉烯类抗生素耐药性，近年来在临床中也越来越多地发现CR-hvKp导致的败血症和尿路感染等。在中国，CR-hvKp检出率高，其中ST11型CR-hvKp是亚洲最常见的类型之一，被认为是导致中国CRKP流行的主要传播株，对临床治疗构成了最大威胁。 替加环素作为一种临床重要的抗生素，为抵御hvKp和CRKP引起的感染建立了强有力的防线。然而，2019年，中国科学家在人类和动物中发现了质粒编码的替加环素耐药基因tet(X3)和tet(X4)，它们能够介导病原体中高水平的替加环素耐药表型。随后，在人类和动物中先后报道了多个可导致替加环素耐药的tet(X)变异体。最近在人体样本、动物来源的食品样本中均发现了tet(X4)阳性肺炎克雷伯菌，这引起了人们的广泛关注，但其传播和流行机制尚不清楚。 李瑞超教授团队从收集的62份猪肉样本中分离出103株四环素耐药菌株，进一步分析得到了6株携带tet(X4)基因的肺炎克雷伯菌，其中一株被鉴定为hvKp。通过齐碳QNome测序平台的全基因组测序、抗菌药物敏感性测试和接合实验，确定了这些分离株的耐药表型、遗传特征和系统发育关系。 本研究首次在猪肉中检出携带tet(X4)的hvKp菌株，并依托齐碳纳米孔测序平台对其进行分子特征和基因组学研究，初步评估该高毒力、高耐药菌株广泛存在造成的潜在风险，突出了全球范围监测的重要性。 总共从62份猪肉样本品中分离出103株四环素耐药菌株，包括95株大肠埃希菌、6株肺炎克雷伯菌和2株枸橼酸杆菌。 抗菌药物敏感性试验结果表明，6株肺炎克雷伯菌对替加环素、土霉素、阿维霉素、氟苯尼考、氯霉素均表现出耐药性，对多粘菌素B和美罗培南敏感。
WGS分析显示，除了tet(X4)基因外，肺炎克雷伯菌分离株中还发现多种药物的重要耐药基因：对β-内酰胺(blaTEM-1, 3/6)，酚类(floR, 6/6)，磺胺类(sul2, 5/6)和四环素(tet(A), 6/6)，表现出多重耐药性。 为进一步了解tet(X)阳性分离株间的进化关系，团队构建了18株tet(X)阳性肺炎克雷伯菌分离株（6株来自本研究，12株来自NCBI数据库）和5个ST5型tet(X)阴性肺炎克雷伯菌的系统发育树。
毒力基因分析发现，只有分离株YZ-58携带多种重要的毒力基因，它们被认为可作为鉴定hvKp的生物标志物，包括rmpA（调节高黏液型表型的产生）、iuc（产aerobactin）和iro（产salmochelin）。
根据粘性拉丝试验，YZ-58具有高黏液型菌株的表型。
基于齐碳纳米孔测序平台数据表明，YZ-58菌株的tet(X4)基因位于IncFII(pCRY)质粒pYZ-58-tetX上
质粒pYZ-58-tetX大小为79kb，平均GC含量为52.9％。在线BLAST比对分析显示，质粒pYZ-58-tetX与肺炎克雷伯菌中发现的质粒pNTT31XS-tetX4 (CP077430)相似性最高（覆盖度98％，序列一致性100％），与质粒pS234-2(CP102188)骨架结构具有高相似性（覆盖度86％，序列一致性99.99％）。此外，该质粒包含一个由多个tra基因组成的IV型分泌系统基因簇。 除分离株YZ-58外，本研究中其他肺炎克雷伯菌株的tet(X4)基因均位于IncFII(pCRY)质粒上，这些分离株携带tet(X4)的质粒骨架结构与pYZ-58-tetX高度相似（图S2）。这些IncFII(pCRY)质粒可以转移至大肠埃希菌C600和ST11型碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌(ST11 CR-hvKp(KP267。连续传代实验结果表明，即使没有外部替加环素压力，tet(X4)和tet(X4)阳性质粒也可以在CYZ-58 (48/48) 和KP267-tetX (48/48)中稳定存在。 在NCBI数据库中通过BLASTn分析表明，IncFII(pCRY)质粒主要存在于肺炎克雷伯菌中。而接合转移结果显示IncFII(pCRY)质粒可以成功地转移到大肠埃希菌和hvKp中，显示出其具有高可转移性。尽管目前tet(X4)阳性大肠埃希菌具有宿主特异性，但其携带的质粒的高度可转移性应引起重视。 随后进一步针对该类型质粒对大肠埃希菌和hvKp的生长影响展开研究，生长曲线显示，接合子的生长速率与C600和KP267没有显著差异(p>0.05)(图4)。这一结果表明，携带tet(X4)基因的IncFII(pCRY)质粒不会显著影响C600和KP267的生长。
本研究从猪肉样本中分离得到6株的tet(X4)阳性肺炎克雷伯氏菌，ST类型各异且tet(X4)基因位于同一质粒IncFII(pCRY)上，并携带多种重要耐药基因，具有多重耐药性。这是首次在全球范围内发现的动物源tet(X4)阳性hvKp菌株。 通过齐碳QNome测序平台进行全基因组测序及质粒特征分析发现，携带tet(X4)基因的hvKp菌株YZ-58与多个国家ST5型肺炎克雷伯氏菌具有高度相似性（基因组差异19~76个SNP），存在克隆传播风险。 IncFII(pCRY)质粒是tet(X4)基因的重要载体，此前大多数IncFII(pCRY)型质粒分布在肺炎克雷伯菌中，在大肠埃希菌中并未发现。本研究接合实验结果显示，tet(X4)遗传元件可转移至大肠埃希菌C600和ST11型CR-hvKp中，表现出高宿主适应性和地理多样性，且具有较高的可转移性。研究还发现，IncFII(pCRY)质粒与ST11型 CR-hvKp的质粒blaKPC-2骨架结构相似，无显著适应代价且能够稳定存在。 令人担忧的是，研究还发现tet(X4)基因可以通过插入序列ISCR2形成一个中间体，使其可能整合到编码blaKPC-2的IncFII(pCRY)型质粒中，导致tet (X4)和blaKPC-2的汇集成为可能，而ST11 型tet(X4)阳性CR-hvKp的出现将严重威胁临床抗感染治疗，使临床治疗面临无有效抗生素可用的困境。 基于本研究成果，强调了针对tet(X4)阳性肺炎克雷伯菌在全球临床和动物养殖环境进一步监测的重要性，应持续关注出现高水平替加环素tet(X4)耐药的高毒力ST11型肺炎克雷伯菌的可能性，并警惕抗生素耐药基因在不同菌属间的转移。
